Инновации в онкологии

Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака

За последние годы в онкологии сделано много, но решающего прорыва не произошло. Все чаще в отечественной и зарубежной литературе появляются сообщения несколько сенсационного плана, свидетельствующие о переломном моменте в лечении больных раком. Прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, развитии методов иммунотерапии, из которых наиболее перспективным представляется создание противоопухолевых вакцин: на основе цельных опухолевых клеток (аутологичных и аллогенных); ДНК или РНК – вакцины; рекомбинантные вирусные или бактериальные вакцины; вакцины на основе аутологичных белков теплового шока и др. (1,2,7.8).

Клиническая онкология имеет большой опыт использования противоопухолевых вакцин эффективность применения которых доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнанны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака (2.3.5.7.8.).

Клетки собственных опухолей, полученные при операции или биопсии, широко используются в мировой онкологической практике для получения иммунотерапевтических препаратов для того же самого пациента. Основной задачей при такой терапии является повышение иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью химической обработки — гаптенизации, генетической модификации — трансфекцией генов кодирующих стимулирующие иммунитет молекулы и вирусной модификации. Последний подход является наиболее технологичным при использовании вируса селективно заражающего опухолевые клетки. Таковым является вирус болезни Ньюкасла (ВБН) — псевдочумы птиц, точнее его вакцинные штаммы – генетически стабильные, апатогенные для млекопитающих, живые вирусные препараты, повсеместно используемые для профилактики заболевания у кур. Преимущественное размножение этого вируса в опухолевых клетках млекопитающих было продемонстрировано более 40 лет назад. С этого времени большим количеством экспериментов на опухолях животных доказана безвредность ВБН для млекопитающих и его достаточно высокая терапевтическая эффективность, особенно в случае сочетания онколитического действия с иммунизирующим воздействием зараженных вирусом опухолевых клеток

Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки: МТН-68,73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер) для человеческих клеток и изучались как противораковые агенты(4-8).

Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия. Первый механизм – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли. Второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию. И, наконец, сам вирус может стимулировать организм носителя вырабатывать цитокины: интерфероны и фактор некроза опухоли (TNF), что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток.

Вместе с тем есть много вопросов в клеточном механизме взаимодействия вируса с организмом. Не совсем ясно, какой из штаммов более эффективен, а также что эффективнее — собственные опухолевые клетки пациента или опухолевые клеточные линии.

Экспериментальные исследования на животных показали, что ВБН и зараженные ВБН раковые клетки могут стимулировать большое разнообразие иммунных ответов, что способствует успешной терапии рака. Доказано — ВБН безопасен, лечение считается безвредным. Эффективность метода в той или иной мере подтверждена клиническими наблюдениями на пациентах с различными злокачественными новообразованиями (II – III фазы испытаний) проведенными в США, Европе и Китае. Представлены результаты исследований использования онколизатов (штамм ВБН 73-Т для лечения метастатической меланомы, а так же рака почки, молочной железы и яичников), цельноклеточных вакцин (штамм ВБН Ульстер для лечения колоректального рака, рака яичников почки, шейки матки) и заражение пациентов литическим штаммом ВБН МТН-68 для лечения рака толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, легких и др. (6.7.8)

Во всех случаях отмечен положительный эффект применения, как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время завершают III фазу клинических испытаний и по мнению большинства исследователей уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака (4-8).

Нами проанализированы результаты и возможности вакцинотерапии большинства клиник, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках допустимых и принятых медицинских программ с учетом мирового опыта в процессе клинических испытаний, в том числе и России.

Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.

Применяемый нами вирус Болезни Ньюкасла, живая вакцина для птицеводства, апатогеный штамм Ла-Сота выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для внесения в человеческие опухолевые клетки и для инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Препарат при необходимости может быть лиофилизован, сохраняя при этом свои свойства в течение одного года.

Для приготовления аутологичной вакцины используют опухолевые клетки, выделенные непосредственно в ходе удаления опухоли. Технология приготовления вакцины общеизвестна и предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности и различные приемы модификации с целью повышения ее эффективности. Этап создания культуры опухолевых клеток представляет собой сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только лишь при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo. Разработанные и применяемые нами оригинальные технологии выделения и культивирования клеток позволяют получить пролиферирующие первичные культуры более чем 70% случаев для таких опухолей как меланома кожи, рак почки, толстой кишки, яичников и молочной железы, а клеточные линии – не менее чем в 50% случаев.

Не менее специфичным в процессе приготовления клеточных вакцин является необходимость инактивировать их способность к размножению с одновременным сохранением их метаболической активности и повышения иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью вирусной модификации. На данном этапе клетки инактивировали гамма-излучением (дозы облучения подбирали индивидуально), замораживали в жидком азоте и использовали для вакцинации в дозах 10 – 50 млн. после обработки 10 — 100 ID50 вируса (ВБН) на клетку.

Более специфическую аутовакцину получали из размножающихся in vitro клетках – перевиваемых опухолевых линиях. Такие линии могут быть получены из операционного или биопсийного материала и могут размножаться бесконечно долго, обеспечивая необходимое для вакцинации количество гомогенных опухолевых клеток. Эти линии также замораживали, инактивировали гамма-излучением и обрабатывали вирусом перед введением пациентам.

Известно, принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека. Недостаточность противоопухолевого иммунитета обусловлена растущей опухолью и/или прогрессированием с возникновением множества метастазов и иммунодепрессивным эффектом противоопухолевой химиотерапии и облучения.

Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов нами достигалась модификацией вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использованием человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активности, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.

Предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии в сочетании с Г-КСФ, а так же наличие клеточных линий полученных на этапах создании позволили пересмотреть принципы и подходы химиотерапии в данном комплексе лечения. Правильный подбор препаратов избирательно действующих на опухолевые клетки, выбор оптимальной дозы, режима и способа применения позволяли проводить курсы химиотерапии длительно без каких-либо осложнений в течение всего курса вакцинотерапии.

Предполагая данную комплексную методику лечения рака, мы учитывали те слабые сторон аутовакцин, где результат зависит от индивидуальных особенностей противоопухолевого иммунитета, а опухоль характеризуется не только множественностью антигенов, но и повышенной мутационной активностью с дальнейшим усилением признаков злокачественности.

Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом в рамках допустимых и принятых медицинских программ провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.

Цель данного исследования: оценить объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных с различными злокачественными заболеваниями при использовании как аутологичных, облученных вакцин модифицированных ВБН (группа А), так и получивших онколитический вирус ВБН в чистом виде (группа В) в плане комплексного лечения.

Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии.
Критерии включения:

  1. Гистологически верифицированный диагноз опухолевого очага
  2. Возраст старше 18 лет
  3. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%)
  4. Отсутствие противоопухолевого эффекта лечения на фоне ранее проводимого лечения или наличие признаков прогрессирования после их проведения.
  5. Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений
  6. Согласие больного на участие в данном исследовании.

Критерии исключения:

  1. Поражение центральной нервной системы
  2. Активный аутоиммунный процесс
  3. Возраст старше 70 лет
  4. Больные с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.
  5. Наличие инфекционных или тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной систем; беременность или лактация
  6. Нарушение функции печени и/или почек (билирубин >1,5хN, креатинин >1,5хN), показатели крови: лейкоциты 9 /Л, Hb <90 г/л, лимфоциты 9 /Л, тромбоциты 9 /Л.

За период 2004-2006 годы в межклиническое проспективное нерандомизированное исследование эффективности и токсичности используемых вакцин было включено 46 больных из них: 9 — меланома кожи , 21 — рак молочной железы, 7 — рак толстой кишки, 5 — рак шейки матки, 1 — рак яичников, 2 больных с увеальной меланомой и 1 больная меланомой влагалища. Средний возраст пациентов составил 54,2 года.

В обоих исследованиях больным вакцину в сочетании с Г-КСФ под/внутрикожно вводили раз в неделю в течение 4х недель, начиная с 4 по 8 недели после операции. В последующем курс продолжали аналогичными инъекциями раз в две недели в течение 1 года, далее уколы делали с возрастающим до 3х месяцев интервалом на протяжении 1,5 лет.

При проведении комбинированного лечения с включением курсов адьювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течении 6 месяцев лечения 29 больных получили аутологичную, облученную вакцину, модифицированную ВБН от 8 до 16 внутрикожных введений, а 17 больных — онколитический вирус болезни Ньюкасла до 16 внутрикожных введений также при 6 месячном курсе лечения.

Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов поражающих не один орган.

Следует отметить, что всем больным (46) проведен полный курс комплексной терапии рака и в последующем проводился курс поддерживающей вакцинотерапии течении 9 месяцев и более амбулаторно. В настоящее время все больные находятся в процессе лечебной или профилактической вакцинотерапии и динамического наблюдения с мониторингом основных жизненных параметров.

Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированных вирусом болезни Ньюкасла вакцины (группа А) и использования онколитического вируса болезни Ньюкасла в чистом виде (группа В) представлены в таблице 1 и 2.

Таблица 1. (группа А)
Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированных вирусом болезни Ньюкасла вакцины.

Локализация/стадия Количество
больных
Лечебный эффект *
ПО ЧО СТ ПР
Меланома кожи Т1-4 N 1-2 M 1 7 2 5
Меланома влагалища Т4 N 2 M0 1 1
Увеальная меланома Т3-4N 1-2 M 1 2 2
Рак молочной железы Т1-4 N 1-3 M0-1 13 2 6 4 1
Рак толстой кишки Т3-4 N 1-2 M 1 5 2 2 1
Рак яичников Т1с N 0 M 1 1 1
ВСЕГО: 29 5 10 13 1

Таблица 2. (группа В)
Результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла.

Локализация/стадия Количество
больных
Лечебный эффект *
ПО ЧО СТ ПР
Меланома кожи Т3 N 1 M 1 2 2
Рак молочной железы Т2-4 N 1-3 M0- 1 8 1 7
Рак толстой кишки Т4 N 1 M 1 2 2
Рак шейки матки Т1-3 N х M0 5 2 3
ВСЕГО: 17 2 1 14 0

* — примечание: критерии лечебного эффекта согласно шкале RECIST:
(ПО) — полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов на срок не менее 4 недель.
(ЧО) — частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30% и более
(ПГ) — прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага.
(СТ) — стабилизация: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование.

Клинические и лабораторные исследования в обеих группах показали, что методы вакцинотерапии нетоксичны, хорошо переносились больными и сопровождались иммунологическим ответом у 42 больных, что подтверждено показателями периферической крови.

Большинство пациентов проходили курсы лечения амбулаторно. В течение всего процесса лечения больные вели произвольный образ жизни. Каких-либо осложнений в процессе комплексного лечения не было отмечено. При завершении 1-го курса лечения исчезала боль, уменьшались метастазы, больные отказывались от наркотических и обезболивающих средств, становились активнее, у них повышался аппетит, и они прибавляли в весе. Отсутствие токсичности делало возможным применение данного метода лечения в течение года и более, до получения стойкого эффекта.

Результаты клинических исследований эффективности использования вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом в комплексной терапии рака в группах А и В (табл. 1,2) показали следующее: лихорадка I и II степени наблюдалась практически у всех больных, сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, не требовала какого-либо лечения и в течение суток самостоятельно купировалась. Локальные кожные реакции в месте введения вакцины, как при первичном, так и при повторных ее введениях: гиперемия и локальный отек в месте введения стихали в течение нескольких дней после вакцинации и не требовали дополнительного лечения. Подобные симптомы, как правило, традиционно наблюдаются при вакцинации разных типов. Возможные побочные эффекты при повторных вакцинациях в течение 4-5 суток после вакцинации вследствие выработки специфических антител в виде лихорадки, озноба, ощущения жара, кожной сыпи, увеличения некоторых групп лимфатических узлов ни в одном из случаев не были зарегистрированы.

Полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов получен у 7 больных (15.2%). Из которых (табл. 1 группа А) 5 (17.2%) больных: рак: молочной железы (2) и толстой кишки (2), 1 больная меланомой влагалища, и 2 (11.7%) больных с распространенным раком шейки матки (табл. 2 группа В). Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями включающих компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения, и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 8 месяцев (от 4 до 16 мес.).

Частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30 % и более наблюдался у 11 больных (23.9 %). Это согласно табл. 1 группа А 10 (34.5%) больных из них: 2 меланома кожи, 6 – рак молочной железы и 2 – рак толстой кишки. В группе В (табл. 2) частичный регресс получен у 1 (5.7%) больной раком молочной железы. Средняя продолжительность эффекта в обеих группах больных составляет 7,7 месяцев.

Стабилизация опухолевого процесса: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить, как прогрессирование наблюдалась у 27 больных (58.7%). Это согласно табл.1 группа А 12 (41.3%) больных: меланома кожи (5), рак: молочной железы (4), яичников (1), толстой кишки (1) и увеальной меланомой(2). Средняя продолжительность эффекта у данной группы больных составляет 7,7 месяцев.

В группе В (табл. 2) стабилизация опухолевого процесса отмечена у 14 (82.3%) больных: меланома кожи (2), рак: молочной железы (7), толстой кишки(2) и шейки матки (3). Средняя продолжительность эффекта в данной группе – 6 месяцев.

Прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага наблюдалось и у 2 больных (6.8%) в группе А: рак молочной железы и меланома кожи.

В таблице 3 суммированы критерии лечебного эффекта комплексной терапии больных со злокачественными опухолями в группах А и В.

Табл.3. Критерии лечебного эффекта использования аутологичной, облученной и модифицированных ВБН вакцины (группа А) и онколитического ВБН (группа В) в комплексной терапии рака.

Критерии эффекта по шкале RECIST Группа А: n*=29
больные / %
Группа В: n*=17
больные / %
Полный ответ 5 / 17.2 % 2 / 11.7 %
Частичный ответ 10 / 34.5 % 1 / 5.7 %
Стабилизация 12 / 41.3 % 14 / 82.3 %
Прогрессирование 2 / 6.8 % 0 / 0 %

n* — количество больных

Анализируя предварительные результаты комплексной терапии рака по данным приведенные в таблице 3 можно сделать следующие выводы:

  • вирус болезни Ньюкасла (апатогеный штамм Ла-Сота) по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей.
  • вакцинотерапия применима в качестве иммунологического адъюванта в комплексной терапии для лечения больных диссеминированными солидными опухолями.
  • вирусная терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом нивелируя иммунодепрессивный эффект противоопухолевой химиотерапии и облучения позволяет проводить комплексную терапию длительно и с эффектом без каких-либо осложнений в течение всего курса лечения.
  • вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных ВБН способны инициировать более выраженный специфический противоопухолевый (терапевтический) эффект в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде в комплексной терапии рака, что делает метод лечения при возможности использования предпочтительным.

Анализ предварительных полученных результатов на небольшом клиническом материале и малые сроки наблюдения за больными не позволяют найти ответы на множество актуальных вопросов. В какой степени видимый клинический успех можно отнести к вакцинации опухолевыми клетками, зараженными ВБН или к чисто вирусной терапии у больных получивших комплексное лечение. Вероятно, пройдет еще немало лет до начала применения программы по вакцинотерапии в клинической практике. Однако систематизация огромного информационного потока, результатов клинических и экспериментальных работ ученых в различных странах мира позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

И уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.

Применение вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом в комплексном лечении рака, может быть реально осуществлено на базе медицинских центров. Экспериментальное производство препарата отработано и не требует больших затрат. Области и схемы применения ВБН в онкологических клиниках могут быть отработаны, с учетом мирового опыта, в процессе клинических испытаний.

Результаты клинических испытаний показали, что все виды клеточных вакцин обладают определенным иммунологическим и клиническим эффектом. Объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных при использовании вакцин показали повышение качества и улучшение перспективы лечения онкологических больных, что позволяет рассчитывать на доминирующую роль данного метода в процессе лечения. Перспективным так же представляется проведение иммунотерапии вакцинами у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.

Вместе с тем следует отметить, что, хотя перспективность использования противоопухолевых вакцин в онкологии можно считать установленной, их внедрение в клиническую практику ограничивается высокой стоимостью, а также довольно сложной технологией изготовления, требующей высококвалифицированного персонала и соответствующего оснащения. Можно надеяться, что создание специализированных лабораторий клеточной медицины, разработка новых методов и совершенствование существующих технологий получения противоопухолевых вакцин позволят уже в ближайшее время использовать их в качестве доступного метода лечения широкого круга онкологических больных.

Опубликовано в журнале «Эпидемиология и вакцинопрофилактика № 3(34)/2007 стр. 23-28 (лауреат государственной премии, д.м.н. В.В. Кешелав)